本文介绍通过 ChIP-seq 法和 ChIP-qPCR 法开展交联ChIP的详细步骤和技巧。
染色质免疫沉淀和测序（ChIP-Seq）是一种允许我们在全基因组水平上分析DNA-蛋白质相互作用的技术。
在这项技术中，我们首先交联染色质复合物，从细胞核中分离它们并将它们片段化。然后，我们可以通过免疫沉淀纯化含有我们感兴趣的蛋白质的染色质片段。在此之后，DNA片段被纯化并测序。我们可以利用测序结果来确定我们感兴趣的蛋白质与之相互作用的DNA区域。
该方案提供了如何在细胞上进行ChIP的具体细节。使用该方案获得的DNA 既可以采用 qPCR（ChIP-qPCR）分析，也可以进行测序（ChIP-seq）分析。在本方案的最后，我们将准备纯化的DNA准备文库制备测序。
我们的方案针对HeLa细胞进行了优化，每个ChIP样品使用来自1×107个细胞的染色质。该方案还强调了不同蛋白质类型（如组蛋白和转录因子）的ChIP-seq流程上的差异。
第1阶段 磁珠的制备
在从你的细胞样本中分离染色质之前，我们应该提前准备好ChIP级抗体和磁珠，以便进行免疫沉淀。
所需材料
- ChIP级一抗
- 蛋白A磁珠
- 蛋白G磁珠
- 用冰冷却的PBS溶液（例如，T494526）
- RIPA-150（50 mM Tris-HCl pH=8.0，150 mM NaCl，1 mM EDTA，0.1% SDS，1% Triton X-100，0.1% Sodium deoxycholate）
- 封闭缓冲液（0.5% w/v BSA，1×蛋白酶抑制剂配制在RIPA-150缓冲液中）
步骤
大约7小时。
1、准备蛋白A/G磁珠的混悬液。将12.5 µL的蛋白A珠子和12.5 µL的蛋白G珠子加入到每个样本的试管中，以制备50:50的混合液。
警告：保持磁珠在4°C环境下。
注意：在准备混悬液之前，可以短暂涡旋磁珠以帮助重新悬浮。
多个实验的磁珠可以在一个池中一起准备。
2、用过量的冰冷PBS洗涤磁珠两次。
2.1 将试管放在磁架上约1分钟；磁珠应被磁铁拉到试管底部。
2.2 吸去溶液并丢弃，保持磁珠在试管中。
2.3 添加过量的新鲜冰冷PBS来洗涤磁珠。
2.4 使用磁铁收集磁珠并吸去溶液。
2.5 再次进行PBS洗涤步骤，使磁珠总共洗涤两次。
3、使用封闭缓冲液封闭磁珠。
3.1 移除上一步中的PBS溶液。
3.2 添加1 mL的封闭缓冲液。
3.3 在4°C下轻轻旋转孵育磁珠30分钟。
4、使用1 mL的RIPA-150洗涤磁珠两次。
4.1 将试管放在磁架上约1分钟；磁珠应被磁铁拉到试管底部。
4.2 吸去溶液并丢弃，保持磁珠在试管中。
4.3 添加约1 mL的新鲜RIPA-150并重复上述步骤。
4.4 再次进行RIPA-150洗涤步骤，使珠子总共洗涤两次。
5、将磁珠与ChIP级的抗体结合。
5.1 在RIPA-150缓冲液中重新悬浮磁珠，以便每个实验500 µL的RIPA-150中有25 µL的磁珠悬液。
5.2 将抗体加入到重新悬浮的磁珠混合物中。我们对组蛋白靶标使用4 µg，对非组蛋白靶标使用8 µg。
5.3 在4°C下轻轻旋转孵育约6小时或过夜。
注意：如果你之前合并了磁珠，你可以在这一步将它们分成单独的样本。
参考制造商的建议以获取确切的抗体浓度。
第2阶段 收获和交联细胞
我们使用甲醛进行细胞交联，以保存DNA-蛋白质相互作用。交联将在准备测序时被移除。
【对于贴壁细胞】
所需材料
- 培养中的细胞
- 冰冷的PBS（例如，T494526）
- 交联剂（甲醛，例如，F111939）
- 猝灭剂（甘氨酸）
- 细胞刮刀
步骤
大约20分钟。
1、用约25 mL的冰冷PBS洗涤细胞并悬浮。
1.1 在细胞达到约90%的密度时从培养箱中取出。
1.2 用10-20 mL的冰冷PBS轻轻冲洗细胞两次。
1.3 丢弃液体，用约27 mL的冰冷PBS吸管。
注意：我们每个样本使用1x107个细胞。确保你培养了足够数量的细胞进行实验。
2、在1%甲醛中交联细胞。
2.1 轻轻向烧瓶中加入甲醛，最终浓度为1%。
2.2 在室温下轻轻旋转孵育细胞10分钟。
警告：在通风柜中执行此步骤。
3、使用甘氨酸猝灭交联。
3.1 轻轻向烧瓶中加入甘氨酸，最终浓度为125 mM。
3.2 在室温下轻轻搅动孵育细胞5分钟。
警告：在通风柜中执行此步骤。
4、在PBS中洗涤细胞两次。
4.1 丢弃烧瓶中的液体。
4.2 用10 mL的PBS轻轻冲洗细胞。
4.3 每次洗涤后丢弃液体，每次洗涤后添加新鲜PBS。
注意：在丢弃含有甲醛的废物时，请遵循当地的处置规定。
5、将贴壁细胞分离并放入一个新鲜的试管中。
5.1 丢弃培养瓶中的液体，将烧瓶放在冰上。
5.2 添加约5 mL的PBS。
5.3 彻底刮取细胞以将它们从培养瓶底部分离。
5.4 将悬浮的细胞倒入一个新鲜的试管中。
5.5 如有必要，重复上述步骤。
【悬浮细胞】
所需材料
- 培养中的细胞
- 冰冷的PBS（例如，T494526）
- 交联剂（4%甲醛，例如，F111939）
- 猝灭剂（甘氨酸）
步骤
大约25分钟。
1、从培养中取出细胞，洗涤并悬浮在约25 mL的冰冷PBS中。
1.1 在细胞达到90%的密度时取出。
1.2 将细胞以1500 g的速度离心至沉淀物（4°C，5分钟），并丢弃上清液。
1.3 将沉淀物在50 mL的冰冷PBS中重新悬浮，并像之前一样离心，丢弃上清液。
1.4 将沉淀物在25 mL的冰冷PBS中重新悬浮。
提示：你可以将多个实验一起准备在一个池中。
2、在1%甲醛中交联细胞。
2.1 轻轻向培养瓶中加入甲醛，最终浓度为1%。
2.2 在室温下轻轻旋转孵育细胞10分钟。
警告：在通风柜中执行此步骤。
3、使用甘氨酸猝灭交联。
3.1 轻轻向培养瓶中加入甘氨酸，最终浓度为125 mM。
3.2 在室温下轻轻搅动孵育细胞5分钟。
警告：在通风柜中执行此步骤。
4、在PBS中洗涤细胞两次。
4.1 将细胞以1500 g的速度离心至沉淀物（4°C，5分钟），并丢弃上清液。
4.2 将沉淀物在约10-20 mL PBS中重新悬浮，并像之前一样离心，每次洗涤后丢弃上清液。
4.3 如有必要，重复上述步骤。
注意：在丢弃含有甲醛的废物时，请遵循当地的处置规定。
第3阶段 分离核部分
在我们可以进行DNA片段化之前，最好先分离细胞核，以减少细胞质蛋白。
所需材料
- 核提取缓冲液1（50 mM HEPES-NaOH pH=7.5，140 mM NaCl，1 mM EDTA，10%甘油，0.5% NP-40，0.25% TritonX-100，1×蛋白酶抑制剂）
- 核提取缓冲液2（10 mM Tris-HCl pH=8.0，200 mM NaCl，1 mM EDTA，0.5 mM EGTA，1×蛋白酶抑制剂）
- 离心机
步骤
大约30分钟。
1、将细胞在核提取缓冲液1中孵育。
1.1 将细胞以1,500 xg的速度离心至沉淀物（5分钟，4°C）。
1.2 将沉淀物在约2 mL的提取缓冲液1中重新悬浮。
1.3 在4°C下轻轻摇晃孵育缓冲液15分钟。
提示：第一个提取缓冲液是温和的缓冲液。
我们每个样本使用1x107个细胞。你可能需要为你实验中使用的细胞数量优化缓冲液的量。
2、将细胞在核提取缓冲液2中孵育。
2.1 将细胞以1,500 xg的速度离心至沉淀物（5分钟，4°C）。
2.2 将沉淀物在约2 mL的提取缓冲液2中重新悬浮。
2.3 在4°C下轻轻摇晃孵育缓冲液15分钟。
注意：我们每个样本使用1x107个细胞。你可能需要为你实验中使用的细胞数量优化缓冲液的量。
第4阶段 超声波断裂
在这个阶段，我们必须超声波处理交联的核裂解液，将DNA剪切成片段。超声波步骤将需要根据使用的细胞系和目标蛋白进行优化。请注意，以下方案基于HeLa细胞的实验操作。
核小体由于与组蛋白的紧密关联而免于断裂，所以组蛋白靶标可能比非组蛋白靶标需要更多的超声波处理。而与此相反的是，非组蛋白靶标可以从更大的片段大小和较少的超声波处理中受益。
除了超声波处理，你可能还想考虑其他形式的断裂，如MNase处理。
所需材料
- 组蛋白超声波缓冲液（50 mM Tris-HCl pH=8.0，10 mM EDTA，1% SDS，蛋白酶抑制剂）用于组蛋白靶标
- 非组蛋白超声波缓冲液（10 mM Tris-HCl pH=8.0，100 mM NaCl，1 mM EDTA，0.5 mM EGTA，0.1% sodium deoxycholate，0.5% sodium lauroylsarcosine，蛋白酶抑制剂）用于非组蛋白靶标
- 超声波器
- 离心机
步骤
大约20分钟。
1、让细胞自然沉淀为细胞团，并用组蛋白或非组蛋白超声波缓冲液重新悬浮细胞，具体取决于你研究的靶标。
1.1 将细胞以1,500 g的速度离心至沉淀物（5分钟，4°C），并丢弃上清液。
1.2 将沉淀物在超声波缓冲液中重新悬浮。
注意：我们使用1 x107个HeLa细胞在350 µL的超声波缓冲液中。
2、用超声波裂解液，将DNA切割为平均片段大小为150-300 bp（组蛋白靶标）、或200-700 bp（非组蛋白靶标）左右的片段。
提示：这一步将需要根据使用的细胞系和感兴趣的蛋白进行优化。
3、使用17,000 g的离心机在4°C下离心15分钟，以沉淀细胞碎片。
3.1 丢弃沉淀物。
3.2 保留上清液并转移到一个新的试管中。
警告：这个上清液包含将用于以下阶段的染色质。
注意：此时可以将染色质快速冷冻，并在-80°C下保存长达2个月。
第5阶段 DNA片段大小的确定
在免疫沉淀目标蛋白之前，我们应该洗脱一个小的测试样本，以帮助我们确定DNA片段的大小，并检查它们是否已经降解。
对于组蛋白，我们应该瞄准150-300 bp的平均片段大小；对于非组蛋白，是200-700 bp。
所需材料
- 直接洗脱缓冲液（100 mM NaHCO3，1% SDS）
- RNAse（10 mg/mL溶液）（例如，R665518）
- 蛋白酶K（20 mg/mL溶液）（例如，P301575）
- 琼脂糖凝胶（1-2%）
- DNA分子量标记（100 bp）
步骤
大约12小时。
1、取出50 µL的超声波样品进行测试。
2、将超声波样品与直接洗脱缓冲液一起孵育。在65°C下用热混器摇动样本4.5小时或过夜。
3、将样品与RNAse A溶液一起孵育。添加2 µL的RNAse A溶液，并在37°C下加热30分钟。
注意：RNAse A包含在缓冲液中，因为高水平的RNA会在使用PCR纯化试剂盒进行DNA纯化时干扰DNA。
4、将样品与蛋白酶K溶液一起孵育。添加2 µL的蛋白酶K溶液，并在55°C下加热1小时。
注意：蛋白酶K切割位于脂肪族和芳香族氨基酸羧基附近的肽键。蛋白质与DNA之间的交联被破坏，这有助于DNA纯化。
5、使用你的标准实验室程序纯化DNA。商业PCR试剂盒或苯酚：氯仿提取。
6、在1-2%的琼脂糖凝胶上运行DNA，以确定片段大小。将观察到的样本条带与已知长度片段的标记进行比较。
注意：如果片段大小太低，或者出现很多小片段，说明样本已经降解。在这种情况下，我们需要从开始重复实验。如果片段大小太大，说明超声波没有足够地剪切DNA。在这种情况下，我们需要对现有样本重复第4阶段（超声波处理）。
7、从第4阶段准备的超声波样品中沉淀细胞碎片，假设DNA片段大小已验证。
7.1 在4°C下以17,000 g的速度离心细胞15分钟。
7.2 丢弃沉淀物。
7.3 保留上清液并转移到一个新的试管中。
7.4 存储在-20°C下，直到准备使用。
提示：这个上清液包含将用于以下阶段的染色质。
第6阶段 免疫沉淀
现在我们准备通过将超声波样品与抗体结合的磁珠混合来进行免疫沉淀。这将纯化与目标蛋白相关联的DNA片段。
所需材料
- 组蛋白靶标IP缓冲液（50 mM Tris-HCl pH=8.0，167 mM NaCl，1.10% Triton X-100，0.11% Sodium deoxycholate）
- 非组蛋白靶标IP缓冲液（10 mM Tris-HCl pH=8.0，100 mM NaCl，1 mM EDTA pH=8.0，0.5 mM EGTA pH=8.0，0.1% sodium deoxycholate，0.5% sodium lauroylsarcosine，1% TritonX，1×蛋白酶抑制剂）
- 蛋白酶抑制剂混合物（例如 P301906）
- 抗体偶联的磁珠（在第1阶段中准备的）
- RIPA-150（50 mM Tris-HCl pH=8.0，150 mM NaCl，1 mM EDTA，0.1% SDS，1% Triton X-100，0.1% sodium deoxycholate）
- RIPA-500（50 mM Tris-HCl pH=8.0，500 mM NaCl，1 mM EDTA，0.1% SDS，1% Triton X-100，0.1% sodium deoxycholate）
- RIPA-LiCl（50 mM Tris-HCl pH=8.0，250 mM LiCl，1 mM EDTA，1% NP-40，0.7% sodium deoxycholate）
- TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH=8.0，1 mM EDTA）
- 磁架
- 管式旋转器
步骤
大约12小时。
1、准备所需的IP缓冲液量。使用前立即添加蛋白酶抑制剂。
注意：根据你研究的靶标，你需要为组蛋白或非组蛋白靶标准备IP缓冲液。
2、如果冷冻的染色质样本（如果冷冻）解冻，并在IP缓冲液中稀释约1/10。即将100 µL的样本添加到约900 µL的IP缓冲液中。
警告：保持染色质样本在冰上。
提示：在这个实验中，我们将100 µL的样本校准为具有1x107个细胞的等效染色质。如果你已经合并了你的样本，你可以在这一步将它们分成单独的管子。
3、在4°C下轻轻旋转孵育染色质样本与抗体偶联的磁珠过夜。
提示：在这个阶段，抗体将与染色质结合。
4、用一系列缓冲液洗涤磁珠以去除背景。
4.1 添加1 mL的RIPA-150缓冲液，将管子放在摇床上2分钟。
4.2 将管子放在磁架上约1分钟；磁珠应被磁铁拉到管子底部。
4.3 吸去溶液并丢弃，保留磁珠在管中。
4.4 重复RIPA-150洗涤步骤，总共洗涤两次。
4.5 将磁珠与约1 mL的RIPA-500洗涤缓冲液混合，在摇床上2分钟。
4.6 将管子放在磁架上约1分钟；吸去溶液并丢弃，保持磁珠在管中。
4.7 重复RIPA-500洗涤步骤，总共洗涤两次。
4.8 将磁珠与约1 mL的RIPA-LiCl洗涤缓冲液混合，在摇床上2分钟。
4.9 将管子放在磁架上约1分钟。
4.10 吸去溶液并丢弃，保持磁珠在管中。
4.11 将磁珠与约1 mL的TE缓冲液混合，在摇床上1分钟。
4.12 将管子放在磁架上约1分钟；吸去溶液并丢弃，保持磁珠在管中。
提示：磁珠用三种缓冲液洗涤；每次更换缓冲液洗涤的严格性都会增加。
第7阶段 洗脱和交联逆转
在这个阶段，我们洗脱并纯化DNA，为测序做准备。
所需材料
- 洗脱缓冲液（100 mM NaHCO3, 1% SDS）
- 磁架
- PCR试剂盒
步骤
大约7小时。
1、将超声波处理过的样本与直接洗脱缓冲液一起孵育。在65°C下的热混器中摇动样本4.5小时或过夜。
2、将样本与RNAse A溶液一起孵育。添加2 µL的RNAse A溶液，并在37°C下加热30分钟。
提示：由于高水平的RNA会在使用PCR纯化试剂盒进行DNA纯化时干扰DNA，因此缓冲液中包含了RNAse A。
3、将样本与蛋白酶K溶液一起孵育。添加2 µL的蛋白酶K溶液，并在55°C下加热1小时。
提示：蛋白酶K切割位于脂肪族和芳香族氨基酸羧基附近的肽键。蛋白质与DNA之间的交联被破坏，这有助于DNA的纯化。
4、使用你的标准实验室程序纯化DNA。使用商业PCR试剂盒或苯酚：氯仿提取。
5、进行DNA文库制备和测序。使用高灵敏度的商业试剂盒来确定免疫沉淀后的DNA浓度更容易。
注意：在测序之前，你可以通过定量PCR实验来检查DNA片段的质量。
