1、细胞复苏 将细胞冻存管从干冰中取出，立即放置37°水浴速融1min，见无冰晶即可不再水浴（用镊子拿取） 将细胞冻存液加入10~15ml完培中，吹打混匀，减少DMSO对细胞毒性，800rpm离心5min 弃上清，细胞沉淀进行下一步传代。 2、细胞传代 试剂与材料（贴壁细胞）： 细胞：4T1乳腺癌细胞；基础培养基：1640培养基（含有生物素、 维生素 B12、对氨基苯甲酸PABA、高浓度的维生素肌醇和胆碱；不含有蛋白质、脂质或生长因子）；血清：胎牛血清FBS（细胞营养液：提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用）；胰酶（消化贴壁细胞促附着蛋白如层黏连蛋白、纤维连接蛋白等） 实验方法： 1）试剂解冻：胰酶，培养基在37°水浴加热解冻 2）制备完全培养基：1640培养基中加入10%的血清，水平摇匀，避免震摇引起泡沫 3）细胞消化：将原来培养基倒除，用500μl首选pbs/胰酶先润洗（消化培养基里的蛋白，避免对细胞生长产生影响），去除胰酶，再沿壁（不直接加到细胞表面）加入1ml胰酶，在37°中消化3~5min（可1min左右观察消化情况）。 4）细胞传代：加入3ml完培，轻柔吹打，取1/4的消化后的细胞（其余的倒掉）加至EP管，在细胞离心机上离心1000rpm 5min，离心后的细胞，轻柔放置，防止细胞混散，可倾倒除去胰酶液（留一点点液体保持细胞活性）快速加入培养基。以10CM培养皿为例：先在皿中加入7ml的培养基。在EP管中悬空加入1~2ml左右培养基（60MM皿3ml培养基；10CM皿10ml培养基），轻柔的吹打，可以沿壁混合，使黏附细胞变成单细胞；将细胞液加入至皿中，划10次8字使皿充分被浸润，放置37°孵育。 5）注意事项： 在进行细胞实验前，需紫外照射生物柜30min，穿戴整齐后方可进入细胞房。 胰酶和培养基需37°水浴加热，至适合细胞生存温度。 开始实验前，关闭紫外照射，打开风橱和灯光。 开始实验时，需要手消且所需物品需要消毒，才可放入生物柜中，台面用酒精棉球消毒 物品摆放整齐，留出空间实验，右手用的在右手，左手用的在左手，切勿交叉。瓶盖用前可拧松，开口朝上或立放。每用完枪头盒，需盖盖，且切勿双手经过枪头盒。实验室，枪杆不要伸入瓶中或管中。 实验结束，所用试剂需标签；清理垃圾和废液；带走自己的东西；关闭灯光和通风橱。 下一次传代前，显微镜中观察细胞生长情况，密度70%~80%左右，即可传代。 试剂与材料（悬浮细胞） thp-1（人急性白血病单核细胞）——显微镜观察时，晃动皿，细胞游动；1640培养基，25培养瓶，10CM培养皿，45mlEP管 实验方法 转移培养皿中的细胞至45mlEP管，移液枪吹打（沿壁吹打，使之变成单个细胞） 1000rpm，离心5min ，得到细胞沉淀 快速倾倒上清液（沿细胞堆积的另一边），保留500μl左右的液体 细胞沉淀加入4ml培养基（反复吹打），培养皿中加入7ml培养基（共10ml），25培养瓶中加入4ml培养基（共5ml） 重悬后细胞液分别移至培养皿和培养瓶中，轻微摇晃，放置37°恒温箱
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